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PathScan^®夹心酶联免疫吸附测定方法

　

A. 准备试剂

1.   使用前将微孔板条调整到室温。

2.   用Milli-Q超纯水或相当级别的水稀释20X漂洗液到1X浓度（漂洗液在每个Pathscan^® Sandwich ELISA试剂盒中都有）。

3.   1 X细胞裂解液：(10X Cell Lysis Buffer #9803)
短时间内这种溶液可以放在4°C（1-2个星期）
注意：CST建议在使用前添加1 mM苯甲磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride ，PMSF）

o 20 mM Tris (pH 7.5)

o 150 mM NaCl

o 1 mM ethylene diamine tetraacetate (EDTA)

o 1 mM ethylene glycol-bis(2-aminoethyl)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)

o 1% Triton X-100

o 2.5 mM sodium pyrophosphate  

o 1 mM β-glycerophosphate 

o 1 mM Na₃VO₄

o 1μg/ml leupeptin

B. 制备细胞裂解物

1.   吸去培养基。换上添加有调节因子的新鲜培养基，处理所需时间。

2.   在非变性条件下收集细胞，去除培养基并用冰冷的PBS漂洗一遍。

3.   除去PBS，每个10 cm培养皿中加入0.5 ml冰冷的含1 mM PMSF的1X细胞裂解液，冰上放置5分钟。

4.   将所有细胞刮下，转移至合适的离心管中。继续放在冰上。

5.   在冰上对样品进行超声处理。

6.   4°C离心1 0分钟，将上清转移到一个新管中。上清即为细胞裂解物。分装成足够一次使用的若干份保存在–80°C。

C. 测试流程：

1.   在微孔板条达到室温后，折下所需数目的微孔。将这些微孔固定微孔板条架上。不用的微孔必须重新封好并立即保存在4°C。

2.   取一微量离心管加入100 μl样品稀释液（包含在Pathscan^® Sandwich ELISA试剂盒内，蓝色）。吸取100 μl细胞裂解液与之混合，涡旋震荡几秒钟。（当用推荐的细胞裂解液处理细胞时，样品上板前可以进行1：1的稀释。）每个试剂盒中的产品说明书提供关于合适的样品稀释倍数和结果分析的信息。

3.   取100 μl稀释后的裂解液加入到相应的微孔中。用胶带封口并用力挤压使胶带贴紧微孔。将微孔板在室温放置2小时。或者将微孔板在4°C放置过夜，以达到对目标蛋白的最佳检测效果。

4.   轻轻除去胶带，然后漂洗微孔：

a.       弃板中液体于废液缸。

b.       用1 X漂洗液洗4次，每次每孔用150 μl。

c.       每次清洗时，将微孔板用力扣在干净纸巾上，弃净所有液体，但注意不要让微孔板完全干掉。

d.       用无尘纸擦拭所有孔的外底面。

5.   每孔中加入100 μl的检测抗体（绿色）。用胶带密封微孔板后室温放置1小时。

6.   重复C4步的洗板操作。

7.   每孔中加入100 μl HRP偶联的二抗（红色）。用胶带密封微孔后在室温放置半小时。

8.   重复C4步的洗板操作。

9.   每孔加入100 µl TMB底物。用条带密封并在37°C孵育10分钟或在25°C孵育30分钟。

10.    每孔加入100 µl STOP溶液。轻轻晃动几秒。

注意：阳性反应孔开始是蓝色，加入STOP溶液后变为黄色。

11.    读取结果

a.       目测或拍照-在加入STOP溶液后30分钟内进行。

b.       分光光度计测量-用无尘纸擦拭所有孔的外底面。加入STOP溶液后30分钟内，在酶标仪上测定各孔在450 nm处的吸光值。

　

　

　

　

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