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酶联免疫吸附试验（ELISA）多肽检测方法

　

A. 所需溶液和试剂

1.   碳酸盐缓冲液：15 mM Na₂CO₃，35 mM NaHCO₃，0.2 g/L NaN₃（pH 9.6）。用碳酸盐缓冲液配制1 μM的合成多肽溶液。

2.   10X磷酸盐缓冲液（10X PBS）：在800 ml蒸馏水中加入80 g 氯化钠（NaCl），2 g 氯化钾（KCl），14.4 g 磷酸氢二钠（Na₂HPO₄），2.4 g 磷酸二氢钾（KH₂PO₄）。调节pH到7.4，定容至1 L。

3.   漂洗液：含0.05% Tween-20的1X PBS （PBST）

4.   封闭液：含10 mg/ml BSA的PBST溶液

5.   抗体稀释液：含3% BSA的PBST溶液

6.   DELFIA^® Europium标记的抗小鼠IgG（针对小鼠源一抗）或抗兔IgG （PerkinElmer Life Sciences #AD0124）（针对兔源一抗）。

7.   DELFIA^®信号增强溶液（PerkinElmer Life Sciences #1244-105）（“DELFIA^®”是PerkinElmer公司的注册商标）

B. 操作方法

1.   用100 μl 1 μM的多肽碳酸盐溶液包被96微孔板，加入溶液后4°C孵育过夜或37°C孵育2-6小时。如果多肽未能结合或吸附上去，则用pH在4-8之间的其他缓冲液尝试。

2.   用漂洗液洗三次，每次每孔用200 μl漂洗液。

3.   每孔加入200 μl封闭液，37°C封闭1小时。漂洗液洗板三次，每次每孔用200 μl漂洗液（晾干的板可以在4°C存放1-2个月，不影响使用）。

4.   用抗体稀释液将一抗稀释到合适的浓度。各孔加入100 μl，37°C孵育1小时。

5.   用漂洗液洗三次，每次每孔用200 μl漂洗液。

6.   将DELFIA Europium标记的抗小鼠IgG稀释成67 ng/100 μl，各孔加入100 μl。37°C孵育半小时。

7.   用漂洗液洗五次，每次每孔用200 μl漂洗液。

8.   加入100 μl信号增强溶液，37°C孵育15分钟。利用适当型号的读板仪在615 nm处测定吸光度。

　

　

　

　

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